分光光度计的应用常识

分光光度计的应用常识

        分光光度计已成为现代分子生物学实验室的常规仪器。常用于核酸、蛋白质定量和细菌生长浓度的定量。
        分光光度计的简单原理
        分光光度计使用可产生多种波长的光源，通过一系列分光装置，产生特定波长的光源。光源通过被测样品后，部分光源被吸收，计算出样品的吸光度值，从而转化为样品的浓度。样品的吸光度与样品的浓度成正比。
        核酸定量
        核酸定量是分光光度计Zui常用的功能。它可以量化溶解在缓冲液中的寡核苷酸、单链、双链 DNA 和 RNA。核酸最高吸收峰的吸收波长为260nm。每种核酸的分子组成不同，因此其换算系数也不同。要对不同类型的核酸进行定量，必须事先选择相应的系数。例如1OD的吸光度相当于50μg/ml dsDNA、37μg/ml ssDNA、40μg/ml RNA和30μg/ml Olig。将试验后的吸光度值按上述系数换算得到相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原溶液和稀释剂的体积，然后测试空白溶液和样品溶液。然而，实验并非一帆风顺。不稳定的读数可能是实验者最头疼的问题。仪器的灵敏度越高，吸光度的变化就越大。
        实际上，分光光度计的设计原理和工作原理是允许吸光度值在一定范围内变化的，即仪器具有一定的准确度和精密度。例如，Eppendorf Biophotometer 的准确度≤1.0% (1A)。此类多次测试的结果在平均值约 1.0% 之间波动是正常的。此外，还应考虑核酸本身的理化性质以及溶解核酸的缓冲溶液的pH值和离子浓度。测试过程中，离子浓度过高，也会造成读数漂移。因此，建议使用一定的pH值和低离子浓度。缓冲器，例如 TE，可以地稳定读数。样品的稀释浓度也是一个不可忽视的因素：样品中难免会有一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在会干扰测试效果。为了尽量减少颗粒对检测结果的影响，要求核酸吸光度值至少大于0.1A，吸光度值优选为0.1～1.5A。在此范围内，粒子干扰较小，结果稳定。
        所以表示样品的浓度不能太低或太高（超出光度计的测试范围）。最后是操作系数，如果混合充分，否则吸光度值太低，甚至为负；混合溶液不能有气泡，空白溶液不能有悬浮物，否则读数会急剧漂移；测试空白溶液和样品必须使用同一个比色皿，否则浓度差异过大；换算系数与样品浓度单位选择相同；不能使用带有磨损窗口的比色皿；样品体积必须达到比色皿和许多其他操作所需的最小体积。
        除了核酸浓度，分光光度计还显示几个非常重要的比率来表示样品的纯度，例如A 260 / A 280的比率，用于评价样品的纯度，因为吸收峰蛋白质的波长为 280nm。对于纯样品，该比率大于 1.8 (DNA) 或 2.0 (RNA)。如果比值低于1.8或2.0，则表明受到蛋白质或酚类物质的影响。 A 230 表示样品中含有糖类、肽类、酚类等污染物。相对纯核酸的A 260/A 230 比值大于2.0。 A 320 检测溶液的浊度和其他干扰因素。对于纯样品，A 320 一般为零。
        蛋白质的直接定量（UV 法）
        这种方法是在280nm波长直接检测蛋白质。选择Warburg公式，光度计可直接显示样品浓度，或选择相应的换算方法将吸光度值换算成样品浓度。
        蛋白质测定过程很简单，先测空白溶液，再直接测蛋白质。因为buffer中有一些杂质，一般需要去掉320nm的“背景"信息，将此功能设置为“on"。与待测核酸类似，要求A 280的吸光度值至少大于0.1A，最佳线性范围在1.0-1.5之间。实验中选择Warburg公式显示样品浓度时，发现读数“漂移"。这是正常现象。事实上，只要A 280 的吸光度值的变化范围不超过1%，就说明结果非常稳定。
        漂移的原因是因为Warburg公式的吸光度值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光度值变化一点，浓度就会被放大，使得结果很不稳定。
        直接蛋白质定量方法适用于检测纯度较高且成分相对单一的蛋白质。与比色法相比，UV直接定量法速度更快，操作简单；但易受平行物质干扰，如DNA；此外，灵敏度低，需要更高浓度的蛋白质。